美國加利福尼亞Salk生物研究所團隊，基于酵母雙雜交和二代高通量測序的高效繪制大規(guī)模，多復用的蛋白互作網(wǎng)絡圖，相關成果以“a massively multiplexedassay for deep-coverage interactome mapping”為題在Nature methods 上發(fā)表。

研究背景：

酵母雙雜交實驗是目前z為廣泛使用的繪制蛋白互作的方法之一，可以幫助科研工作者鑒定目的蛋白涉及的相關互作網(wǎng)絡，豐富蛋白互作的資源庫。但由于成本、時間、現(xiàn)有技術的的限制，大規(guī)模的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖譜繪制是一項很大的挑戰(zhàn)。一種大規(guī)模、多復用的深度覆蓋互作網(wǎng)絡繪制的實驗方法（CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping）的出現(xiàn)為高通量大規(guī)模鑒定蛋白互作提供了可能。研究人員利用Cre重組酶作為Y2H蛋白互作報告因子，在細胞內(nèi)通過特異識別蛋白編碼序列的loxP位點，共價單向的連接互作的誘餌和捕獲質粒。連接的蛋白編碼序列充當互作識別DNA分子，結合二代高通量測序手段，實現(xiàn)了大規(guī)模、多重復的篩選蛋白互作網(wǎng)絡的要求。

研究目的：

以酵母雙雜體系為基礎并結合二代測序技術，從而實現(xiàn)高通量大規(guī)模鑒定蛋白互作網(wǎng)絡的目的。

研究結果：

美國加利福尼亞州索爾克生物研究所基因組分析實驗通過改造酵母雙雜AD和BD載體及轉化酵母菌菌株，構建了可以利用DNA測序技術檢測蛋白質互作結果的實驗方法。

1、研究人員首先開發(fā)了一個攜帶由gal4誘導的GAL7::CRE表達盒和GAL1::HIS3和GAL2::ADE2缺陷營養(yǎng)表達盒酵母菌株CRY8930。然后，改造了一個廣泛使用的ARS/CEN gateway兼容質粒，使其包含單向lox序列側翼的ORF插入片段3 '端，這樣在Cre重組時，兩個ORF插入片段將以固定方向位于同一DNA分子上，這樣就可以通過篩選在這些重組質粒的酵母轉化子，從而鑒定相互作用的蛋白。

2、研究人員使用1,956個擬南芥轉錄因子為誘餌質粒，使用CrY2H-seq技術體系，篩選擬南芥酵母文庫，通過測序分析共鑒定得到8577組相互作用的擬南芥轉錄因子互作網(wǎng)絡。

3、對于上述結果，研究人員使用 AtTFIN-1進行互作驗證，通過Michaelis–Menton 模型擬合曲線發(fā)現(xiàn)使用CrY2H-seq技術體系篩選到的互作蛋白的數(shù)量并沒有達到飽和，僅有理論的54.6%，所以使用CrY2H-seq技術體系時需要進行多次篩選，綜合多次篩選結果來提高實驗的可信度。

4、選取檢測到的AtTFIN-1互作頻率多的3,086 個高置信度 AtTFIN-1 相互蛋白（2,578組新互作）研究其生物學意義。發(fā)現(xiàn)互作蛋白在生長素響應和不同激素和脅迫信號方面的巨大潛能。上述分析擴展的ARF–AUX–IAA互作模式，揭示了特定的如何在介導生長素反應和其他植物途徑之間的串擾中發(fā)揮特定作用。