近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳發(fā)棣教授團隊在International journal of molecular sciences上在線發(fā)表了題為Development of a Transformation System and Locus Identifification Pipeline for T-DNA in Chrysanthemum seticuspe, A Model Species for Hexaploid Cultivated Chrysanthemum 的研究論文。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院副教授宋愛萍為該論文的通訊作者。源寶生物為本研究提供了T-DNA檢測服務(wù)！

一、研究背景

菊花是具有很高的審美和商業(yè)價值。然而，六倍體栽培菊花基因組高度雜合，這為菊花基因功能研究帶來了困難。甘野菊Gojo-0作為菊屬二倍體純合子株系，有望成為菊屬的模式植物。通過對Gojo-0轉(zhuǎn)基因體系的建立和轉(zhuǎn)基因植株的鑒定，有望為菊花基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

二、研究結(jié)果

01、在植物組織培養(yǎng)和發(fā)育過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑對植物外植體不定芽的形成有很大影響，在9個不同6-BA和NAA濃度組合下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的激素濃度組合中Gojo-0芽分化率有顯著的差別（Figure1），在M1 (MS + 1.0 mg·L−1 6-BA + 0.2 mg·L−1 NAA)培養(yǎng)基中Gojo-0的誘導(dǎo)效果最好（Figure2）。

02、卡那霉素、濕霉素和草銨膦三種篩選劑對Gojo-0的葉盤再生均有抑制作用（Table1）。當(dāng)培養(yǎng)基中卡那霉素濃度達(dá)到10 mg/L；潮霉素濃度達(dá)到2.5 mg/L；草銨膦濃度達(dá)到0.6 mg/L時Gojo-0不定芽出芽率為0（Figure3）。并且，卡那霉素、潮霉素和草銨膦對Gojo-0生根也有顯著的抑制作用（Table2，F(xiàn)igure4）。在三種篩選劑中，潮霉素對Gojo-0的毒性最高，草銨膦其次，卡那霉素最低。

03、對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行驗證，通過PCR檢測目的條帶，顯示5個抗性苗的擴增片段大小與質(zhì)粒的擴增片段大小相同，陰性對照中沒有擴增條帶（Figure5B），對5個PCR驗證陽性植株進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示5個轉(zhuǎn)基因株系的葉片被染成藍(lán)色，以上結(jié)果表明目的基因成功轉(zhuǎn)入Gojo-0植株中。

04、通過對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行高通量測序、將數(shù)據(jù)Mapping到質(zhì)粒左邊界(LB)到右邊界(RB)的區(qū)域，將相關(guān)reads進(jìn)行組裝后獲取旁側(cè)序列。通過與Gojo-0基因組比對，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入到基因組的Cse2.0_LG3: 240,085,670位置，并且通過PCR對鑒定結(jié)果進(jìn)行驗證（Figure5D）

三、研究結(jié)論

通過建立菊屬二倍體純合植物Gojo-0的轉(zhuǎn)基因體系，并且可以促進(jìn)菊花基因編輯和種質(zhì)資源的創(chuàng)新和發(fā)展，為菊花的種質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。另外轉(zhuǎn)基因插入位點分析流程也可應(yīng)用用于其他轉(zhuǎn)基因植物的鑒定。