文章標(biāo)題：酵母雙雜交文庫(kù)高通量測(cè)序鑒定，提供了全新的酵母文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)！

研究背景

酵母雙雜交(Y2H)是研究生物中蛋白互作的經(jīng)典方法，但存在假陽(yáng)性比例高的特點(diǎn)限制了其廣泛的應(yīng)用。目前傳統(tǒng)的文庫(kù)鑒定方法僅通過(guò)鑒定文庫(kù)的庫(kù)容和片段的長(zhǎng)度來(lái)判斷酵母文庫(kù)的質(zhì)量，該鑒定方法存在隨機(jī)性和單一性的問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)一種新的文庫(kù)鑒定方法來(lái)評(píng)價(jià)酵母文庫(kù)的質(zhì)量對(duì)于酵母雙雜體系的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要的意義。

研究目的

本文開(kāi)發(fā)了一種新的方法來(lái)評(píng)估文庫(kù)，只需要構(gòu)建一個(gè)10 ng的文庫(kù)，通過(guò)15次PCR擴(kuò)增插入片段，然后進(jìn)行高通量測(cè)序。該方法消除了傳統(tǒng)方法的隨機(jī)性和單一性，同時(shí)可獲得插入基因數(shù)量、基因豐度等關(guān)鍵指標(biāo)，可有效評(píng)價(jià)文庫(kù)的質(zhì)量。

技術(shù)路線

研究結(jié)論：

1、傳統(tǒng)的庫(kù)容鑒定方法是將50 μL菌液稀釋1000倍后涂LB平板并過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)平板上的單克隆數(shù)來(lái)計(jì)算構(gòu)建文庫(kù)的庫(kù)容；而插入片段的長(zhǎng)度和重組率是在過(guò)夜平板中隨機(jī)挑選24個(gè)單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，并觀察擴(kuò)增片段在300 ~ 2000bp之間的比率。

2、本研究開(kāi)發(fā)新的鑒定方法是通過(guò)12、15、18次循環(huán)的PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)12和15次循環(huán)PCR產(chǎn)物的條帶約為2000bp，而18次循環(huán)PCR產(chǎn)物的條帶僅為1000bp左右。而且15次循環(huán)PCR純化產(chǎn)物的樣品添加量最低，但這些條帶仍然是最亮。因此，5次循環(huán)的PCR產(chǎn)物質(zhì)量最高，對(duì)上述的循環(huán)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PE150的高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量不少于6G。

3、通過(guò)對(duì)不同循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行De Novo拼裝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)PCR循環(huán)次數(shù)從12次增加到15次時(shí)，基因數(shù)、N50、中位數(shù)和平均長(zhǎng)度均略有增加，但當(dāng)循環(huán)次數(shù)增加到18次時(shí)，所有參數(shù)均急劇下降。因此，PCR循環(huán)數(shù)為15，擴(kuò)增效率最好。根據(jù)基因豐度和均勻度分析，在12和15次循環(huán)周期中均無(wú)顯著偏離PCR擴(kuò)增，但在18次循環(huán)中觀察到偏離，這與電泳圖譜的結(jié)果一致。綜上所述，15次循環(huán)為評(píng)價(jià)Y2H文庫(kù)質(zhì)量的最佳循環(huán)次數(shù)。

4、傳統(tǒng)的酵母文庫(kù)檢測(cè)方法只能提供文庫(kù)容量信息和非常有限的文庫(kù)插入長(zhǎng)度，不能有效評(píng)價(jià)文庫(kù)質(zhì)量。在新的檢測(cè)方法中，僅使用了10 ng的文庫(kù)質(zhì)粒，通過(guò)高通量測(cè)序，獲得了文庫(kù)的插入基因數(shù)、基因豐度等關(guān)鍵指標(biāo)。因此該方法可以有效地評(píng)價(jià)文庫(kù)的質(zhì)量。此外，新的文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法還可以獲得非模式物種的基因序列，為下一步克隆編碼互作蛋白的基因提供信息。而且這種方法適用于任何類型的酵母文庫(kù)。

交付標(biāo)準(zhǔn)：文庫(kù)容量（E.coli）：≥1×10^7 cfu；重組率：≥90%；插入片斷平均大于1kb。示例如下：